慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科,包括8種能夠感染人和脊椎動(dòng)物的病毒,原發(fā)感染的細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主,感染個(gè)體最終發(fā)病。慢病毒感染患者早期很難觀察,大多經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的潛伏期,之后緩慢發(fā)病,因此稱(chēng)為慢病毒(Lentivirus)。慢病毒通常與免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病有關(guān),如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)會(huì)導(dǎo)致艾滋病。
慢病毒載體是以慢病毒基因組為基礎(chǔ),對(duì)其自身元件進(jìn)行改造而發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)能夠攜帶外源基因的病毒載體。根據(jù)來(lái)源,主要有HIV-1、HIV-2、SIV等不同類(lèi)型,其中HIV-1型載體系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。
與其他病毒相比,慢病毒有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):
宿主更廣泛
對(duì)于分裂和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
穩(wěn)定表達(dá)
慢病毒基因組可整合于宿主基因組,因此可以長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因。
可攜帶大約5kb或更長(zhǎng)的外源基因片段
基于慢病毒載體的優(yōu)點(diǎn),其被廣泛應(yīng)用于RNAi、基因治療以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等研究中。體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的慢病毒載體,然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,使其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA,可發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。同時(shí),以慢病毒作為基因載體的多種基因療法已在國(guó)內(nèi)外開(kāi)展臨床研究,效果非常理想,在基因治療中擁有廣闊的應(yīng)用前景。
當(dāng)使用慢病毒載體感染細(xì)胞時(shí),通常需要濃縮病毒顆粒以獲得高滴度,特別是需要感染大量細(xì)胞或者用于某些對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抵抗力的細(xì)胞系時(shí)。離心是濃縮病毒的一種簡(jiǎn)單有效的方法,這里我們介紹兩種常用的濃縮慢病毒載體的方法。
PEG濃縮法
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種無(wú)電荷的線(xiàn)性分子結(jié)構(gòu)的多糖,為乙二醇的聚合物,具有高親水性,在溶液中會(huì)吸收大量水分,減少病毒之間的距離,使病毒聚合在一起,提高病毒的相對(duì)濃度,達(dá)到沉淀濃縮的目的。
基本流程:
收集病毒上清液,使用0.45 μm濾膜過(guò)濾,除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片。
將上清液與40% PEG溶液混合(可使用PEG8000、4000或6000),最終PEG濃度為10%。冰上放置3到6小時(shí)。
放于Avanti J-15R離心機(jī)中,2000 ×g 離心30 min。
去掉上清,使用1/20原始樣品體積的PBS緩沖液對(duì)離心后形成的沉淀進(jìn)行重懸。
為了進(jìn)一步濃縮,將重懸后的病毒樣品轉(zhuǎn)移到已預(yù)先消毒的超速離心管(Ultra-Clear Tube #344058)中,并使用PBS緩沖液進(jìn)行配平。
(注:可選用無(wú)菌無(wú)酶離心管 #C14292)
按次序?qū)⒊匐x心管放置于SW 32 Ti的吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭放置于Optima XPN-100超速離心機(jī)中,100,000 ×g(24,500 rpm)離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清,注意不要將病毒顆粒倒出。
使用PBS或其他病毒存儲(chǔ)液重懸沉淀,并將所有管中的樣品集中在一個(gè)離心管中。
集中的病毒樣品分裝后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
蔗糖墊液離心法
為更好地保持病毒顆粒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的完整性,超速離心濃縮時(shí)經(jīng)常在管底加入蔗糖墊液,使病毒樣品在到達(dá)管底時(shí)沉降減速或不形成沉淀。
基本流程:
收集病毒上清液,使用0.45 μm濾膜過(guò)濾,除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片。
在已預(yù)先滅菌的超速離心管(Ultra-Clear Tube #344058)底部小心加入3-5 ml 20%蔗糖墊液。
(注:可選用無(wú)菌無(wú)酶離心管 #C14292)
小心地將病毒上清液加至離心管中蔗糖墊液上。
將超速離心管配平后小心放入吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭放置于Optima XPN-100超速離心機(jī)中,4℃,125,000 ×g離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清,注意不要將病毒顆粒倒出。
加入PBS或其他病毒存儲(chǔ)液重懸沉淀,可選擇在4℃下溶解2小時(shí),每20分鐘輕輕震蕩。
對(duì)離心得到的病毒樣品進(jìn)行分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
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******相對(duì)離心力:175,000 ×g
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參考文獻(xiàn):
1. https://baike.baidu.com/item/慢病毒
2.https://media.beckman.com/-/media/pdf-assets/application-notes/centrifuge-application-note-lentiviral-vector-preparation-ultra.pdf
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