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Exosome外泌體是細(xì)胞外泌囊泡中體積較小的一種。近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。外泌體在很多生理病理起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同的細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物，也可用于靶向藥物的定向傳輸。

樣本準(zhǔn)備：外泌體分離需要多少起始材料？

成功分離外泌體所需的起始材料，取決于你所研究的體液、所選擇的分離方法以及將進(jìn)行的下游分析。外泌體的濃度隨體液類型和疾病狀態(tài)而異。最好對(duì)目標(biāo)體液和疾病所涉及的外泌體濃度進(jìn)行評(píng)估。知道樣品所含外泌體的濃度之后，你還需要了解自己所選外泌體分離方法的效率，你可以采用標(biāo)準(zhǔn)化外泌體樣品或微球進(jìn)行計(jì)算， 然后可以反推計(jì)算達(dá)到所需的總體積，其中考慮到樣品損耗和外泌體裂解引起的外泌體損耗。成功分離外泌體后，你希望確保所選下游分析具備足夠的起始材料（DNA、RNA、蛋白質(zhì)）?，F(xiàn)有方案的初始體積范圍最低為3～4mL，最高為50mL。

制備方法：用什么方法分離外泌體，以及如何表征這種混合的外泌體群體？

過(guò)濾后采用低轉(zhuǎn)速除去完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大聚集體。使用轉(zhuǎn)頭速度超過(guò)100,000×g 的貝克曼超速離心機(jī)高速離心處理2小時(shí)以上，可以沉淀、濃縮外泌體。

如需對(duì)外泌體群體進(jìn)一步純化分離，建議以轉(zhuǎn)速為100,000×g的5～40% 碘克沙醇非連續(xù)性密度梯度離心法處理18小時(shí)以上。分離外泌體并確認(rèn)其回收率之后，在臺(tái)式超速離心機(jī)中以超過(guò)100,000×g的轉(zhuǎn)速處理外泌體1.5～2小時(shí)，即可令外泌體沉淀。外泌體群體一般通過(guò)光散射法、二代基因測(cè)序法及蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行表征。

儲(chǔ)備條件：樣品儲(chǔ)存條件（包括從不同來(lái)源分離出來(lái)的外泌體溫度），以及外泌體分離前生物體液和細(xì)胞培養(yǎng)樣品的儲(chǔ)存條件？

使用的純化外泌體儲(chǔ)存在 -20℃ 條件下，而長(zhǎng)期儲(chǔ)存的溫度則為 -80℃。我們尚未發(fā)現(xiàn)不同外泌體來(lái)源在儲(chǔ)存條件影響方面存在任何差異。

大多數(shù)生物體液（尿液、精液、唾液等）可以在分離外泌體之前存放于 -80℃ 條件下。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，大多數(shù)細(xì)胞系在37℃、5% CO2條件下儲(chǔ)存。

內(nèi)含物表征：如果我們進(jìn)行以下操作，總共需要花多長(zhǎng)時(shí)間？

1、從細(xì)胞培養(yǎng)基和血漿中提取外泌體
首先是3個(gè)不同的沉淀步驟，共需2個(gè)小時(shí)，接著進(jìn)行隔夜密度梯度離心步驟，目的是分離出細(xì)胞培養(yǎng)基或血漿中的外泌體。

2、RNA分離、NGS和分析 
用Biomek 4000分離RNA約花費(fèi)3小時(shí)，接著是特定RNA類型的富集（供NGS使用）。NGS和分析高度取決于所采用的系統(tǒng)和所進(jìn)行的分析類型。

外泌體分離純化的金標(biāo)準(zhǔn)

超速離心分離是從生物體液和細(xì)胞培養(yǎng)樣品中分離純化外泌體的黃金標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確地重復(fù)獲取外泌體，同時(shí)******限度減少蛋白質(zhì)聚集體和其他膜粒子的共純化。

Exosome的離心純化標(biāo)準(zhǔn)流程

差速離心富集法

密度梯度離心法

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